Aktywacja Mutacji Stymulującego białka G w zespole McCune-Albrighta czesc 4

Żele zabarwiono srebrem (zestaw Bio-Rad). Mapy topnienia fragmentów eksonu 8 i 9 przewidywały, że DGGE wykryje mutacje w dowolnym miejscu w obrębie sekwencji kodujących. Hybrydyzacja oligonukleotydów swoistych dla alleli
Próbki PCR (3 do 20 .l) denaturowano w 0,2 N wodorotlenku sodu, 15 mmolach kwasu TRIS-chlorowodorowego na litr (pH 7,5) i 3,75 mmol EDTA na litr przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie kropkowano na filtry nylonowe (Oncor Sure Blot). Filtry inkubowano przez dwie godziny w piecu próżniowym o temperaturze 80 ° C, a następnie hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi znakowanymi końcowo fosforem-32 (długość 20 zasad), które zawierały sekwencję argininy typu dzikiego w pozycji 201 (R201; CGT), substytucję cysteiny dla argininy w pozycji 201 (R201C, sekwencja kodonu, TGT) lub substytucję histydyny dla argininy w pozycji 201 (R201H, sekwencja kodonów, CAT). Sekwencje sondy oligonukleotydowej, jak również warunki hybrydyzacji i płukania zostały opisane wcześniej. Wyniki z reprezentatywnej tkanki pozytywnej i negatywnej zostały potwierdzone przez analizę niezależnego preparatu DNA z tego samego bloku parafiny.
Wyniki
Amplifikacja i analiza eksonów 8 i 9
Genomowy fragment DNA o 204 parach zasad (bp) obejmujący ekson 8 został zamplifikowany przez PCR z próbek tkanek lub krwi od czterech pacjentów. Próby amplifikacji szeregu próbek kości zawartych w wszczepach Pacjentów 2 i 3 zakończyły się niepowodzeniem, prawdopodobnie z powodu degradacji DNA podczas kwaśnego odwapnienia tych próbek.34, 35
Rysunek 1. Rysunek 1. Analiza próbek tkankowych od pacjenta 1, kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej. Zamplifikowane przez PCR fragmenty genomowe obejmujące ekson 8 z tkanek kontrolnych i z tkanek od Pacjenta analizowano zarówno przez DGGE, jak i hybrydyzację oligonukleotydową specyficzną dla allelu (ASO). W tym ostatnim przypadku próbki DNA hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi zawierającymi R201 typu dzikiego i zmutowane sekwencje R201C. Zatwierdzona w parafinie normalna tkanka nadnerczy została wykorzystana jako kontrola negatywna, a jako kontrola pozytywna zastosowano guz przysadki, o którym wiadomo, że zawiera mutację R201C. W próbkach analizowanych przez DGGE wykryto dwa dodatkowe górne prążki heterodupleksowe w kontroli pozytywnej i we wszystkich próbkach od pacjentów, podczas gdy zmutowane pasmo homodupleksowe było widoczne tylko w próbkach o najwyższym odsetku zmutowanych alleli (kontrola pozytywna i wątroba).
Produkty PCR były następnie analizowane za pomocą DGGE, metody, która umożliwia szybkie badanie mutacji, w tym substytucji jednozasadowych, w regionie DNA. Dwuniciowe fragmenty DNA składające się z niedopasowanych dzikich i zmutowanych nici (heterodupleksów) będą się łatwiej topić niż te składające się z dwóch dopasowanych nici (homodupleksów), a zatem będą migrować na krótszą odległość w gradiencie denaturującego DNA powielonego z normalnych tkanek. ujawnił jedynie pasmo homodupleks typu dzikiego (ryc. 1, kontrola negatywna). DNA amplifikowany z guzów przysadki, o których wiadomo, że zawierają substytucję R201C lub R201H, ujawnił nienormalny wzór z dwoma wolniej migrującymi pasmami heterodupleksowymi i zmutowanym prążkiem homodupleksowym oprócz pasma typu dzikiego (Fig.
[patrz też: dyżury aptek olecko, kolorowe żele do paznokci, nieulotne cda ]